Faible teneur en protéines de poids moléculaire tyrosine phosphatase (PTP LMW)

Original: http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/research03.htm

Les enzymes qui clivent les groupes phosphates de protéines sont abondantes dans toutes les cellules. Ces enzymes, appelées phosphatases, régulent l’activité de protéines phosphorylées, rendant les protéines déphosphorylés actifs ou inactifs. Phosphatases sont des protéines clés dans la régulation de la croissance des cellules et de l’état métabolique. J’étudie à bas poids moléculaire protéine phosphatase de tyroysl humaine (PTP). Dr McIntee (Chimie Dept) et je collaborent pour étudier les substrats protéiques naturelles de cette enzyme et à développer des médicaments pour inhiber son activité.

La protéine est constituée d’un ADNc inséré dans un plasmide, pGEX-6P1 qui est utilisé pour transformer E. coli. L’expression du gène est induite par addition d’IPTG, ce qui active le promoteur lac, conduisant à la formation d’une protéine de fusion GST-PTP. Le site actif de l’enzyme, où le clivage chimique du groupement phosphate se produit, doit se lier à des groupes phosphate qui sont attachés de manière covalente à des protéines cibles. L’activité de l’enzyme peut être contrôlé facilement en solution en utilisant du phosphate de p-nitrophénol qui est clivé par l’enzyme pour produire une solution jaune. Un site actif cystéine (Cys 12) agit en tant que nucléophile dans la réaction de clivage. L’enzyme se lie au phosphate dans le site actif, ce qui inhibe de façon compétitive l’enzyme.

Mon groupe de recherche a fait une série de mutations dans l’ADN de PTP et nous sommes à étudier l’effet de ces mutants sur son activité. Les mutants peuvent être divisés en deux groupes:

1. active mutant du site: Le site actif Cys 12 (C12) est remplacé pour un Ser (C12S). Cela rend l’enzyme catalytiquement inactive, incapable de cliver des groupes phosphate à partir de protéines. Cependant, ce mutant sera toujours capable de se lier phospho-protéines. Nous allons utiliser ce mutant dans les recherches futures de se lier à phospho-protéines naturelles dans les cellules épithéliales et de graisse, et d’identifier les sites de liaison sur les phospho-protéines pour PTP.

2. non actifs mutant du site: PTP contient deux tryptophanes (W). Nous avons réalisé deux mutants différents, en changeant un seul W de phenylalanine (F) dans chacun d’eux, en produisant ainsi deux mutants qui contiennent seulement un résidu d’O. Nous avons changé W49, un acide aminé qui se trouve à proximité du site actif et qui émet une fluorescence, de F, qui ne fluoresce pas. Nous avons également réalisé un second mutant W39 à modifier, située sur le côté opposé du site actif, à une phénylalanine. La fluorescence du mutant avec un seul W en position 49 sera sensible à l’environnement du site actif, tandis que l’autre mutant, contenant un seul W en position 39, sera utilisée pour détecter les changements dans la structure des protéines en dehors du site actif et servira de contrôle.

L’activité des deux protéines mutantes, telle que mesurée par le clivage du phosphate de p-nitrophényle et de la fluorescence, en présence et en absence de différents inhibiteurs de l’enzyme, seront utilisés pour mieux comprendre comment la structure de l’enzyme influe sur son activité. En outre, la stabilité et le déroulement de la protéine seront étudiés utilisés fluorescence des mutants contenant tryptophane simples.

Nous avons également réalisé un double mutant: C12S / W39F, produisant une protéine qui ne peuvent pas cliver les phosphates de protéines cibles (C12S) et qui a un seul W à la position 49 (W39F) qui sera utilisé pour surveiller la liaison de la phospho-protéine double mutant en surveillant les changements de fluorescence dans W49.

De plus, nous étudions la protéine et son interaction avec les inhibiteurs par la modélisation informatique silico de VMD / NAMD et Autodock de la protéine.
Les applications des mesures de fluorescence en biochimie

Mon deuxième projet consiste à utiliser le spectrofluorimètre à étudier une série de questions biologiques. Quand les molécules absorbent la lumière UV ou visible, les électrons sont excités à des niveaux élevés de l’énergie. Les électrons excités peuvent “se détendre” retour à des niveaux d’énergie inférieurs par perdre de l’énergie par collisions ou en émettant des photons d’énergie inférieure à celle des photons d’excitation d’origine. Cette émission de fluorescence est appelé. Contrairement aux propriétés d’absorbance simples, l’émission de fluorescence est très sensible à l’environnement du fluorophore, la molécule qui émet. Les propriétés des molécules biologiques peuvent être étudiés en utilisant la fluorescence. Deux types de fluorophores sont utilisés. Fluorophores intrinsèques sont une partie de la molécule réelle (par exemple, une chaîne latérale de tryptophane dans une protéine). Fluorophores extrinsèques (tels que la fluorescéine) peuvent être fixés (de manière covalente ou non covalente) à des protéines, des agrégats lipidiques et de l’ADN. Nous développons des projets de recherche utilisant la fluorescence pour étudier la transition de la structure et des interactions des protéines, des lipides et l’ADN de liaison.
Mon groupe de recherche

À l’été 2008, j’ai deux étudiants, Rob Hvalicek (SJU) et Yang Lin de l’Université du Sud-Ouest (UTS), Beibei, Chongqing, la République populaire de Chine.

Voici une liste de certains de mes étudiants de recherche passées et un peu sur ce qu’ils font actuellement;

Année

Étudiant, Degrés | Actuellement (dernière position connue / statut de 16.07.08)

08-09 Robert Hlavacek, Senior, SJUYang Lin, Senior, SWU
07-08 Andrew Hipp, applying to medical schoolJing Ying (SWU)
06-07 Nick Menthe, M.S. xxx, | Presently Adjunct Faculty, Biology Department, CSB/SJUWang Jing (SWU)
05-06 Claire Hoolihan, MPH, Environmental Health, University of Minnesota | Presently …Nick Briese, medical student, University of Minnesota
03-04 Adam Barker, medical student ? |
02-03 Dr. Dustin Lorentz, M.D., University Minnesota | Presently …
01-02 Elizabeth Cody, Dr. Jennifer Klein, Ph.D. Biochemistry, University of Minnesota | Presently …

Dr. Anna Selmecki, Ph.D.,Molecular, Cellular, Developmental Biology & Genetics, University of Minnesota | Presently …

00-01 Dr. Jason Bartos, Ph.D. Pharmacology, University of Iowa.  | Presently medical student, Stanford UniversityDr. Karla Ziegelmann-Fjeld,  Ph.D Biochemistry, Michigan State University, | Presently at MicroBioLogics

Dr. Aaron Krych, M.D., Mayo Medical School, | Presently Resident in Department Orthopedic Surgery, Mayo Clinic

99-00 Jessie Odenthal  |  Presently …,
98-99 Dr. Amanda Sinness, M.D. North Dakota State University | Presently …Katie Garvey (nutrition)  Presently …
97-98 Eric Schneider  |Presently …Ryan Rubischko | Presently …
96-97 Dr. Scott Loecken, M.D. University of Minnesota | Presently …
95-96 Dr. Michael Kennedy, Ph.D., Mayo Graduate School, | Presently Research Assistant Professor and Director, Educational and Research Programs, Northwestern University  
94-95 Jill Funk  | Presently …Dr. Jill Holbrook, M.D./Ph.D University Wisconsin, Madison.  | Presently Post-doc in Molecular Medicine Partnership Unit, European Molecular Biology Laboratory, Department for Pediatric Oncology, Hematology and Immunology, University Hospital Heidelberg
93-94 Dr. Manu Chakravarthy, M.D/Ph.D., University of Texas Medical School and the M.D. Anderson Cancer Center;  | Presently Instructor of Medicine, Washington University Dr. Rob Bellin, Ph.D. Biochemistry, Iowa State University | Presently Associate Professor Biology, Holy Cross

Mary Pennas |  Presently …

92-93 Jeffrey Vos | Presently …
91-92 Dr. Steve Van der Louw, Ph.D. Chemistry, Iowa State University | Presently …Dr. Brenda Weyer (Sorensen), Ph.D. Biochemistry, University of Iowa. | Presently in Biochemistry Department, University of Iowa.

Comments are closed.